一般5×10^6 就足夠了。

懷疑是樣品問題，可能是： 

1，樣品不能反復凍融； 

2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查WesternBlot 過程， 提高一抗濃度。對于加蛋白酶抑制 劑來說，一般加PMSF 就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

①免疫組化可以用來進行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區分；Westernblot 可以特異性檢測某個蛋白質分子，進行定量，但是不能定位。 

②兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫 組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

NaF 是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。

可能是：

a)樣品濃度過低；

b)轉移時間不夠。

a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。

b)蛋白本身的修飾 如：糖基化，磷酸化等。

DAB 有毒，但是比較靈敏，是 HRP 最敏感的底物；ECM 結果容易控制，但被催化時靈敏度差一 點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。

a)可能是紅燈造成的,膠片本來就被曝光了，可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.；

b)顯影 時間過長。

如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現在一抗和抗原制備上。

a)二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光； 

b)ECM 底物中H2O2，不穩定，失活； 

c)ECL 底物沒覆蓋到相應位置； 

d)二抗失活。

你的一抗濃度較高，二抗上 HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處于一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現象”。將一抗和二抗濃度降低，或更換新底物。

減少抗原上樣量，降低一抗濃度，改變一抗孵育時間，提高牛奶濃度。

可以加大抗原上樣量，這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。