一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉 下來，結果較差。PVDF 膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這 樣的話，PVDF 膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。

影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素： 

（1）電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充分發揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠 55v，分離膠75v 就能跑得很好。 

（2）膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠.

均可在室溫進行，如果時間不夠，一抗孵育可以先在室溫進行一個小時，然后4 度過夜。

是 Tween，配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),NaCl：8g，Trisbase：2.42g加水 800ml 溶解,加500-1000ul 的Tween-20,用HCl 調節 pH至7.4,加水定容至1L。

選用beta-actin 就可以。

一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。除非有文獻特別指明用特殊 的方法，一般來說都沒有區別。

可以選用組蛋白，組蛋白在細胞核中的表達是很穩定的，有很多都可以當成內參，在網上 查查就可以選出你要的內參。

一般來說，是小分子量Marker 跑走了，增加膠濃度或減少電泳時間試試看。當然梯度膠也是不錯 的選擇。

對于發表文章的實驗最好加內參，實驗嚴謹。

可以考慮：轉移緩沖液中加入 20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇可降低蛋白質洗脫效率，但可 增加蛋白質和NC 膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉 移時間；轉移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也是為了增加轉移效率；用優質的轉移膜，或使用 小孔徑的NC 膜（0.2 微米）。

這么廣的分布不好轉移，一般建議：21kd 和66kd 可以一起轉，12％SDS-PAGE，濕轉 120mA，45-60min 就可以了，可以根據你實驗室的經驗調節；170kd 用7%SDS－PAGE， 200mA90-120min。

沒什么問題，就是你膠里的水分被蒸發了。過夜時拿保鮮膜包起來，在里面加點水保持濕度就可以 了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有問題，你可以重新配制一份觀察；能夠替換的試劑，盡量換一 下，選用好的試劑。