通過LC3-Ⅱ水平看細胞自噬的發生

自噬（autophagy）是在真核細胞中，過量或異常的細胞器被雙膜泡隔離并交付給溶酶體/液泡后被降解，回收利用細胞性物質及清除受損細胞器或有害的蛋白質的過程。自噬的過程包括隔離膜（isolation membrane）或自噬前體（pre-autophagosome）的形成及延伸、自噬體（autophagosome）的形成、自噬體和溶酶體融合后形成自噬溶酶體（autolysosome），最終胞內物質降解，產生的降解產物如氨基酸、脂肪酸等可被細胞再利用。

自噬在維持細胞內穩態發揮重要的生物學作用：①應對外源性刺激，自身降解重新獲得生長所需營養物質。②細胞自我更新，降解胞內衰老蛋白和細胞器后重新合成蛋白和細胞器。③防御性清除胞內受損大分子物質，維持細胞正常功能。

既然自噬對維持細胞穩態如此重要，那么，自噬檢測怎么做呢？說到這里就不得不提到公認的自噬標志物——微管相關蛋白1的輕鏈3（microtubule-associated-proteinlight-chain-3，LC3）。正常情況下，LC3以未脂化的可溶性形式存在于胞漿中，被稱為LC3-Ⅰ，其分子量為18kDa。自噬形成時，LC3-Ⅰ酶解轉化成為膜型LC3，又被稱為LC3-Ⅱ，其分子量為16kDa。LC3Ⅱ在聚丙烯酰胺凝膠上表現出的遷移率高于LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ與噬小體/自噬溶酶體的數量呈正相關，所以LC3-Ⅱ被廣泛地應用于定量細胞自噬的活性。

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LC3與綠色熒光蛋白（GFP）結合成LC3-GFP顯示出與LC3相同的過程，并且可通過監控液泡輸送和GFP-LC3后續的分解而示蹤自噬通量。當自噬通量正常，存在于自噬體內部的GFP-LC3在自噬體膜融解且暴露于液泡水解酶的內容物被裂解。GFP-LC3的蛋白水解可釋放出一個完整的GFP部分，因其對降解有相對抗性，可作為自噬產物累積在液泡。自由的GFP水平增加可被檢測且可通過Western印跡分析進行定量，并與自噬率相關。GFP是酸敏感型GFP蛋白，由于自噬溶酶體內部的酸性環境，可以導致pH下降、GFP淬滅，因此，GFP的強弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度。除了以上LC3-II檢測試劑盒，Cell Biolabs當然還可以提供GFP-LC3表達質粒（cat#CBA-401）：

左側是pCMV-GFP對照質粒；右側是pCMV-GFP-LC3表達質粒

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